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利用血清篩選噬菌體文庫交叉抑制實驗

[器材和試劑]●多孔板（ImmunoplateMaxisorp，Nuno）●TBS●PEG—純化噬菌體●PBST●封閉液（含5％脫脂牛奶，0．05％Tween—20，0．02％NaN3的PBS）●XLl—Blue細菌提取物●堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG（Fc特異性）抗體（Sigma）●底物緩沖液（10％二乙醇胺，0．5mmmol/LMg-2，0．05％NaN3，用HCl調(diào)節(jié)至pH9．8）●顯色液（在底物緩沖液中加1mg/mlp硝基苯磷酸）●自動酶標儀[方法]1．將100ul含...

利用血清篩選噬菌體文庫PCR擴增的模板

[方法]1．用無菌塑料吸嘴挑取一個AmpR噬菌粒菌落（直徑大約lmm）并將其轉(zhuǎn)入到0．2mlMicroAmp反應管中，內(nèi)含20u1洗脫緩沖液。在GeneAmp9600PCR儀中，95℃加熱樣本10分鐘（避免用離心澄清，因為加熱可使細胞碎片黏附在管底）。2．將菌落提取物作為該克隆的主拷貝保存。另外，這些菌落也可以直接轉(zhuǎn)移到PCR反應體系中，并在PCR程序中插入加熱步驟。此時，可將克隆主拷貝穿刺接種到在用UV滅菌并鋪有LB—瓊脂培養(yǎng)基+Amp的微板孔中。3．配置PCR反應體系：將...

噬菌體展示文庫T7活體篩選的特殊步驟

CAS號：3844-53-9中文名稱：L-賴氨酸乙酯二鹽酸鹽其他中文名稱：英文名稱：H-Lys-OEt?2HCl其他英文名稱：L-Lysineethylesterdihydrochloride產(chǎn)品規(guī)格：特純英文名稱：H-Lys-OEt·2HCl；L-LysineethylesterdihydrochlorideCAS號：3844-53-9C8H18N2O2·2HC1=247.17的別：Purum含量：≥98.0%熔點：145℃比旋光度：+10±1°（c=2%in...

噬菌體展示文庫體外篩選的通用步驟

1．通過腹腔注射濃度為1．25％（w/v）的阿佛丁來麻醉小鼠。2．打開胸腔并暴露心臟。3．用10ml的DMEM或PBS來灌注小鼠。4．連同一個或多個對照器官一起，取出要研究的器官和組織，并將其置于一個直徑為30m的細胞培養(yǎng)皿中。5．用無菌刀片將每個器官或組織都切碎。6．將切碎的器官或組織放到2．2m1的無菌塑料管中，并加入1．8m10．5mg/m1的膠原酶。混勻并在37℃搖瓶孵育30分鐘。在37℃培養(yǎng)時，持續(xù)搖動樣品。7．以1500r/min的速率短暫離心細胞懸液5分鐘，并棄...

pG6質(zhì)粒簡介，pG6質(zhì)粒說明

pG6質(zhì)粒是噬菌體顆粒載體，是為融合蛋白的單價展示設計的。來自輔助噬菌體的野生型pⅥ與噬菌體顆粒載體表達的pⅥ-cDNA的融合蛋白競爭合成原始的噬菌體顆粒。在多鏈接區(qū)域除了有一個額外的SalI位點以外，實際上噬菌體顆粒載體pG6A、pG6B、pG6C與載體pDONG6是等同的，pDONG6允許在gⅥ的3’末端進行eDNA文庫克隆。從lac啟動子轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生雙側(cè)順反子mRNA：*條順反子在lacZ和gⅢ3’末端之間編碼一個融合蛋白，而第二條順反子包含了gⅥ-eDNA融合基因。g...

從預制的入GTll文庫中制備cDNA插入片段

[方法]A.PCR擴增cDNA插入片段1．在冰浴中將以下成分加到0．2m1微量離心管中（執(zhí)行10步反應）●水，36．5ul●10×Pfu緩沖液，5．0ul●10mmol/LdNTP，1．5ul●λGTll正向引物（10umol/L），2．5ul●λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul●已制備好的Sfi-NotIλGTllcDNA文庫，1．Oul●PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul2．混合反應物并用50ul的礦物油覆蓋。3．在95℃下使模板變性2分鐘，...

從外周血淋巴細胞（PBls）中分離RNA

[方法]1．收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細胞。2．用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細胞3次。3．在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細胞，并加入7ml裂解緩沖液（可溶解達到5×108個外周血淋巴細胞），然后劇烈渦旋振蕩以溶解細胞。4．加入7體積（49m1）4m01/L氯化鋰，4℃孵育15～20小時（過夜）。5．將懸液轉(zhuǎn)移到30mlCorex管內(nèi)，在吊桶式轉(zhuǎn)頭內(nèi)4℃離心2小時，6500r/min。6．棄去上清，并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰（大約15m...

cDNA*鏈的合成

[方法]1．為合成cDNA*鏈，在1個1．5ml硅化微量離心管中制備以下反應混合液，●10－RT緩沖液，5ul●20×dNTP，5ul●100mmol/LDTT，5ul●HuIgMFOR引物，2ul●HuCκFOR引物，2ul●HuCλFOR引物，2ul●RNAsin，80U（2ul）●所有引物濃度均為10pmol/ul2．取整數(shù)體積（1～4ug）存于乙醇中的RNA，放在1個無菌1．5ml微量離心管內(nèi)，并用微型離心機離心5分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀1次，晾干，并用24．5ul...