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大規(guī)模連接及純化連接后的DNA

[方法]1．建立以下連接反應：●載體DNA（pG6AppG6B，pG6C）（10ug）xul●cDNA片段（3～5ug）yul●10×連接緩沖液40ul●T4DNA連接酶（6WeissU/ul）5ul●水400ul2．在16℃過夜孵育。3．在70℃孵育30分鐘，使T4DNA連接酶變性。4．加1體積的乙醇并振蕩45秒，在14000g微離心機中離心10分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的微離心管中。5．加1體積的24/1（體積比）氯仿/異戊醇并振蕩45秒，在14000g微離心機中離心...

Topl0F’細胞中的電轉(zhuǎn)化及文庫儲存

[方法]1．加2～3ul純化的連接反應物（zui大值為0.3ugDNA）到80ul的*0F’電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞中，輕輕搖晃混合。使用30ng（2ul）的pUCl9控制電轉(zhuǎn)化效率。2．將細胞+DNA懸浮液轉(zhuǎn)移到已冷卻的0．2cm細胞電轉(zhuǎn)化管，并冰浴3分鐘。3，將GenePulserPlus電穿孔儀設(shè)置為2．5kV脈沖，電容器設(shè)為25uF，脈沖控制器設(shè)為200ns。4．用紙巾干燥電轉(zhuǎn)化管，然后將它放在電轉(zhuǎn)化箱中，使用一個脈沖（寄存時間常量必須為4．5～5．0毫秒）。5．立即加lml...

gⅥ-cDNA噬菌粒文庫小規(guī)模的獲取和純化

[方法]1．將克隆體接種到100ulLBAT96孔培養(yǎng)板上，并在37℃過夜振蕩培養(yǎng)（180r/min）。2．使用96孔復制板將其接種到裝有200ulLBAT的第二塊96孔培養(yǎng)板上，在37℃培養(yǎng)直到生長中期（大約1，5小時）。3．在每一孔中加入10ul2×1011TU/mlR408輔助噬菌體。4．37℃無振蕩培養(yǎng)30分鐘。5．37℃過夜振蕩培養(yǎng)。6．4℃800g離心20分鐘，收集細胞。7．將上清液轉(zhuǎn)移到一新的96孔培養(yǎng)板上，并加40pulPEG/NaCl。8．將板放置于冰上1小...

gⅥ-cDNA融合噬菌體ELISA

[方法]1．用200ulPBST沖洗鏈霉素包被的微量濃度測定板的每個孔3次。2．在2mol/LPBS中稀釋生物素配體（BAS噬菌體—ELISA）或生物素捕獲抗體（ISA噬菌體—ELISA），直到終濃度為10—50nmol/l，再加100ul這種溶液到農(nóng)度測定板中的每個孔中。3．在室溫下孵育濃度測定板1小時。4。用200ulPBST沖洗每個孔5次。5．在2mol/LPBS中稀釋噬菌體溶液到濃度為1×1011TU/ml，在*次用來稀釋IAS融合噬菌體的2mol/LPBS中加入誘餌...

用scFv接頭PCR裝配VH和VL進行scFv基因文庫的構(gòu)建

[方法]1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制以下PCR反應混合液。配制成2個“反應管”，1個含有V。文庫DNA，另1個則含有Vl文庫DNA。反應管對照1對照2●scFV接頭DNA（100ng/ul）1．0ul1．0ul●VH文庫DNA（100ng/ul）3．5ul1．0ul●V-文庫DNA（Vκ或Vλ）（100ng/ul）3．0ul1．0ul●水6．5ul5．5ul2．在每管中加入：●水，33ul●10×Vent緩沖液，5．0ul●20×dNTP，2．5ul3．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱...

再擴增scFv基因文庫以添加限制性位點進行克隆

[方法]1．在0．5ml微量離心管中，配制兩個50/z1PCR反應混合液（1個用于VH—VκscFv文庫，另1個用于Vu—VλscFv文庫），其中含有：●水，36．5//1●10XTag緩沖液，5．0ul●20XdNTP，2．5ul●正向引物，2．0ul●反向引物，2．0ul●scFv基因文庫（約long），1．0ul2．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應管到94℃，5分鐘。如果沒有加熱蓋，則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應液。3．加入1．0ul（5單位）TdQDNA聚合酶。4．以94℃1分鐘...

對scFv基因文庫及pHEN1噬菌體展示栽體的限制性消化

[方法]1，配制兩個100ulPCR反應混合液來消化scFV文庫，其中1個用于VH-VκscFv文庫，另1個用于VH-VλscFv文庫，該混合液含有：●scFVDNA（1～4ug），50ul●水，33ul●10×NEB3緩沖液，10ul●乙酰BSA（100×），1．0ul●Nco工（10U/ul），3．0f11●NoJ工（10U/ul），3．0ul2．37℃孵育反應液過夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置，防止水分蒸發(fā)?；蛘撸梢园碢CR反應那樣加一層礦物油（Sigma...

電轉(zhuǎn)化連接物構(gòu)建抗體文庫

[方法]1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。2．在冰上復溶電感受態(tài)細菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細胞和DNA均放于冰上。3．將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電弧）。啟動脈沖，立即加入1．0ml...